番茄溃疡病检测操作流程及关键步骤

番茄溃疡病检测操作流程及关键步骤  

一、现场检疫与抽样  

症状观察：检查番茄植株、茎秆、叶片及果实是否出现典型症状，如叶片边缘干枯、茎部溃疡斑（维管束变褐、髓部腐烂）、果实表面“鸟眼斑”（白色晕圈中央黑褐色小点）等。  

抽样规范：按《SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样》标准执行，每份种子样品需种植5000粒以上（最少3000粒），果实或病株样本需采集病健交界部位，经70%酒精或7%次氯酸钠表面消毒后备用。  

二、实验室检测步骤  

种植观察  

将种子种植于灭菌土壤/基质中，在24-34℃、湿度≥70%条件下培养，出苗后15天内观察幼苗是否出现萎蔫、坏死斑点等典型症状。  

分离培养  

使用半选择性培养基（如SCM、mSCM）划线培养，25-28℃培养7-10天，观察菌落特征（如D2ANX培养基上黄色黏液状菌落，YDC培养基上圆形凸起黄色菌落）。  

挑取可疑菌落进行纯化，通过紫茉莉接种或番茄幼苗穿刺接种验证致病性。  

分子生物学检测  

提取DNA后，采用PCR技术扩增目标片段（如引物5'-TCAGGCGTCTGTTCTGGC-3'和5'-CCCACCACCATCCACAAC-3'，预期产物223bp），通过2%琼脂糖凝胶电泳分析，结合DNAMarker判定结果。  

致病性测定  

紫茉莉接种：菌悬液浓度1×10⁷CFU/mL，注射后18-36℃培养36-48小时，观察过敏性坏死斑。  

番茄幼苗接种：在子叶与真叶间茎部穿刺接种，25-32℃光照培养，2-3周后观察萎蔫、溃疡斑等症状。  

三、结果判定与质量控制  

判定标准：需同时满足症状符合典型特征、分离菌落形态匹配、致病性测定阳性、分子检测扩增目标片段等条件，方可判定为番茄溃疡病菌（Clavibactermichiganensissubsp.michiganensis）。  

对照设置：每批次检测需设阳性对照（标准菌株）、阴性对照（无菌水）及空白对照，确保实验可靠性。  

设备与安全：操作需在超净工作台或生物安全柜中进行，实验废弃物经高压灭菌处理，接触病原菌后洗手消毒。  

四、田间诊断要点补充  

多部位侵染特征：同时危害叶片（叶缘干枯）、茎秆（溃疡斑、维管束变褐）、果实（鸟眼斑），区别于根腐病等单一部位病害。  

环境关联性：高温高湿（24-34℃、湿度≥70%）易发病，雨水/喷灌传播，种子带菌可远距离扩散。